课程内容

《基因工程的基本操作程序》
目的基因的获取
目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗逆性基因（抗病毒、抗细菌）、人胰岛素基因等。
目的基因的获取方法
1）从基因文库中获取目的基因
因文库的概念：将含有某种生物不同基因的很多的DNA片段，导入到受体菌群中储存，每个受体菌含有这种生物不同的基因。
基因文库的分类：
（1）构建基因组文库：
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定大小的DNA片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入受体菌中储存，这个群体包含了这种生物的所有基因。
（2）构建cDNA文库
用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段（也叫cDNA），与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。
原核细胞的基因结构
RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。
编码区是间隔的、不连续的。
其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。
2）利用PCR技术扩增目的基因
原理：DNA双链复制
前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。
1、目的基因DNA受热变性，解链；
2、引物与单链互不结合；
3、合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。
变性→复性→延伸
聚合酵素连锁反应是一种快速的DNA复制方法；图中绿色的部分，是DNA分子中要扩增的片段；加热至95℃，以热处理打开互补的两股DNA分子；温度降至60℃，两个引子可与目标DNA片段两端的特定序列结合；使DNA聚合酵素能以DNA的两股同时作为模板，从5’端到3’端合成新的DNA。（温度升至72℃，提高酵素的活性）；温度降至35℃，下一回合。新的DNA被合成后，可当做下一个回合的DNA模板，于是每循环这个反应一回合，DNA分子的数目就会加倍；利用温度的变化，驱动酵素循环反应，达到快速复制目标DNA片段的效果；经过三十个回合，即可吧DNA分子的数量放大百万倍。
3）人工合成
如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪直接人工合成。
（二）基因表达载体的构建——核心
基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
（三）将目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
转化——目的的基因进入受体细胞内，并且子啊受体细胞内维持稳定和表达的过程。
方法：导入植物细胞——农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
导入动物细胞——显微镜注射法
导入微生物细胞——感受态细胞吸收DNA分子
1、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上
将目的基因导入微生物细胞
1、常用菌：大肠杆菌
2、微生物作受体细胞的原因：繁殖快、多位单细胞、遗传物质相对少
3、转化方法：
Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（四）目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入目的基因——DNA分子杂交
是否转录——分子杂交
是否翻译——抗原-抗体杂交
如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。
个体鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。